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RNA电泳液,10×说明书

RNA电泳液,10×说明书

产品编号:BTN3150

规格:100mL/250mL

产品及特点:

本产品是预配的10×RNA 专用电泳液(即10×MOPS 电泳液),专门用于RNA 电泳分析。

1. 即开即用,用户不需要自己进行RNase 灭活、高压菌、pH 调节等操作。

2. 与Northern杂交等后续反应兼容。

规格及成分:

成分

100ml

250ml

RNARUN

100ml

250ml

说明书

1份

1份

保存条件:

常温运输及保存,有效期一年。

自备试剂:

琼脂糖、37%甲醛、EB (10 mg/mL)、去离子甲酰胺。

使用方法

一、用本产品配制琼脂糖甲醛变性胶(1.2%, 100 mL)

1. 在三角瓶中加入下列成份:

琼脂糖 1.2 g

DEPC水 87 mL

2. 将琼脂糖加热融化后,加入10 mL 本产品。

3. 待胶冷却至60°C 左右,再加下列成份:

37%甲醛 3.0mL

EB (10 mg/mL) 2-4L

4. 混匀后倒胶, 凝固半小时后即可以使用琼脂糖甲醛变性胶(需要量RNA 变性上样液和RNA 电泳液)。

二、用本产品配制RNA 变性上样液(以一个RNA 样品为例)

本产品 2.0L

37%甲醛 3.5L

去离子甲酰胺 10.0L

RNA 样品 4.5μl

85℃变性10 min,冰浴冷却5 分钟后加RNA 变性上样液后直接上样。

三、用本产品配制RNA 电泳液

将本产品用无RNase 的水稀释十倍后即可直接用于RNA的琼脂糖甲醛变性胶使用。

四、电泳条件

电泳时,将凝胶预电泳5 min(电压为5 V/cm)。随后加样品和分子量对照(如果有的话),以3-4 V/cm 的电压电泳,直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4 处。电泳结束后,在紫外灯下拍照。

注意事项

每一泳道至多可分析30g RNA,通常用10-20g 总RNA 进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA 含量极微,每个泳道需加0.5-3.0g poly(A)+ RNA。

溴酚蓝泳动速度相当于300bp DNA,二甲苯青FF 泳动速度相当于4Kp DNA。

疑难解答:

Q:RNA 电泳为何好使用RNARUN,不要使用DNA 电泳液TAE 或TBE?

A:一是因为RNARUN 经过去RNase 处理,而一般实验室使用的TAE 或TBE都没有经过去RNase 处理,故极有可能含RNase,使样品RNA 降解。即使要灭活TAE 或TBE 中的RNase 也十分麻烦,因为DEPC 不能处理含Tirs的缓冲液;二是TEB 含有硼酸,硼酸是研究多羟基醇和糖的经典试剂,它能与RNA 中含多羟基的核糖反应生成糖硼酸络合物,故电泳时RNA 带型十分弥散。在一定浓度范围内,RNA 分子间还能通过硼酸形成分子间复合物,出现电泳时各种RNA 以一条带的形式出现的现象。所以RNA 电泳时要避免使用含硼酸的缓冲液。使用TAE 效果虽然比TBE 稍好,但文献报道(BioTechniques2000, 28:414-415),它不能分离某些大小不同的RNA 分子。

Q:上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA 吗?

A:不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象,初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合(如果使用TBE 作电泳液的话)形成的复合物,加RNase

处理后,这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象,建议好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶,也必须在上样前使RNA 变性。使用我司基因优化的上样/变性/染色三用溶液RNAON 可以使RNA 在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时, 可以使用TAE 或超快电泳液SuperBuffer-2,好不要使用TBE 缓冲液,因为TBE 中的硼酸能与RNA 的多羟基形成复合物,RNA很难形成锐利的条带。

Q:如何确认和去处除污染的基因组DNA?

A:如果怀疑有DNA污染,可以用RNase 处理RNA 样品,然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失,则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA 去除剂DNA Erasol 或RNase-free DNase,由于RNase-free DNase 一般都有残留的RNase污染,所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。

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