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一管式病毒RNA提取试剂盒说明书

一管式病毒RNA提取试剂盒说明书

产品编号:BTN3073

规格:50T/200T

产品及特点:

本产品是专用于血清(血浆)等液体样品中提取病毒RNA的纯化试剂。本产品回收率极高,尤其适合于整合到临床RT-PCR检测试剂盒中。且能用于提取其他液体样品和微量样品。

1. 回收率达到90%以上,高于绝大部分基于离心柱的提取方法。

2. 灵敏度高,RT-PCR检测到的终灵敏度可以达到50-100拷贝/mL(对HIV和HCV)。

3. 一管式操作,不使用离心柱,整个操作过程均在室温下完成。

4. 无毒环保,不需要使用苯酚和氯仿等有毒的有机溶液。

5. 可放量,如果加上病毒离心富集步骤,每管多可以处理样品1.5 mL。

规格及成分:

成分

50T

200T

溶液A

30ml

120ml

说明书

1份

1份

保存条件:

常温运输,4℃保存,有效期一年。

自备试剂:

异丙醇,70%乙醇。

使用方法

一:准备工作

1. 血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD,不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积,样品会被稀释,得到的病毒滴度会比使用EDTA低15%左右。

2. 用于制备血浆的全血在2-25℃放置的时间不能超过6小时,在此时间内,可以室温800-1600g离心20分钟,上清即为血浆。

3. 血浆可以在2-8℃或更低温度下运输,可以在室温放置一天,2-8℃放置5天,-20℃以下长期保存。

4. 血浆好按0.6mL/管的量分装保存,以避免反复冻融。

5. 实验前所有试都必须放置在室温。

6. 实验当天新鲜配制70%的乙醇。

二:病毒提取操作

1. 标记1.5-2 mL螺旋盖塑料离心管(如Sarstedt CAT#:782.694.006),为避免污染,建议不要使用压盖式塑料离心管。注意设置阳性和阴性对照。

2. 每管(包括正负对照管)中加入0.6 mL病毒RNAOUT溶液(需提前融化)。

3. 快速震荡样品几秒,再短暂离心,取0.2 mL液体样品加入到已经装有0.6 mL病毒RNAOUT溶液的管中。如果病毒需要富集,可以将1.5 mL液体样品在4℃ 24,000 g冷冻离心60分钟, 移弃1.3 mL上清后在取用样品。

4. 在正负对照样品管中分别加正负对照样品。

5. 室温放置10分钟。此间可以在每个管上做个标记,以在下步区别向心面和离心面。

6. 振荡数秒后加入0.7 mL室温异丙醇,旋紧盖后振荡30秒混匀,把离心管的向心面对向转头的中央,13,000-15,000 g室温离心至少15分钟。

7. 小心移弃上清,注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀(此时可能看不见)。

8. 加入1.0 mL 室温70%乙醇, 振荡数秒后 15,000 g室温离心5分钟。注意:在离心机中放置离心管时将其向心面对向转头的中央。

9. 小心移弃上清,注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀(此时呈膜状沉淀)。

10. 再短暂离心数秒, 用移液器移弃残留液体(70%乙醇),否则它会影响后续反应。

11. 加入200 μl RNase-free水或百奥莱博的1×液相RNase Erasol(能灭活残留的RNase, 而RNase-free水无此功能),用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁离心面的膜状RNA沉淀,溶液将呈混浊状,含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA,所以不要离心后取上清使用,必须取混合液使用,哪怕很浑浊。

12. 直接取适量用于RT-PCR,如果溶于200 μL,同时样品使用量不超过RT-PCR体系的1/2,不溶物一般不会影响RT-PCR。剩余样品可以室温放置2小时,也可保存于-80℃保存一个月。

疑难解答:

Q:提取液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难?

A:原因一是量少。病毒颗粒中的RNA或DNA是作为遗传物质保存,每个病毒多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万个RNA分子),同时其长度也十分有限(是细胞基因组的万分之一以下),样品中病毒数往往也不是很多,使得样品中核酸的对量几乎是微乎其微,十分容易丢失。另外,由于得到的核酸量少,不能使用电泳和测OD检测,只能通过PCR或RT-PCR检测,而病毒RNA往往具有稳定的二级结构,进一步增加了鉴定的难度(即不知道是RNA提取的问题还是RT-PCR的问题)。

Q:如何判断是病毒RNA没提取出来还是提取出来了但没有RT-PCR成功?

A:在RT-PCR反应中加阳性和阴性对照。

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